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利用原位酶谱技术测定土壤酶活性

来源:贵州戎测质检技术服务有限公司 | 发布时间:2023-02-11 | 浏览次数:1086次

土壤酶是陆地生态系统物质转化及元素循环的重要参与者与驱动者,由于土壤酶对土壤理化性质及环境因子的变化有较高的敏感性,因此其种类多样性及活性不仅可以反映土壤的健康状况和肥力水平,也是表征土壤微环境中植物、微生物的状态和变化的敏感指标。


土壤酶活性检测方法中最常用的是化学比色法,该方法有一些不足,如需要破坏性取样,样品需要前处理、测定周期较长等。而土壤原位酶谱技术是对土壤酶活性及其二维分布进行原位可视化和定量的一种新研究技术,可以对土壤酶活性时空分布进行精细化研究,最早应用于植物根际土壤酶活性研究,以揭示植物⁃植物及植物⁃土壤微生物的相互作用,探究变化环境下土壤质量变化(如干扰、胁迫及土壤恢复等)以 及土壤微生物群落组成、活性和功能的改变,该技术目前仍然有诸多不足,但也不失为一种值得关注的土壤酶研究方法。


1 土壤原位酶谱技术

原位酶谱技术的操作理念最早源于免疫印迹,一种将细胞或组织中的蛋白质通过电泳的形式从凝胶转移到固相支持物硝酸纤维素薄膜或聚偏二氟乙烯膜上,然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。引入土壤酶学研究中后,使用硝酸纤维膜作为底物溶液的载体和底物⁃土壤反应的表面,并以此为基础对根际土壤磷酸酶进行原位检测。


土壤原位酶谱技术的操作方法为通过在土壤样品表面贴附一张被待测酶的特异性荧光标记底物的饱和溶液浸泡过的膜,使底物与土壤酶接触,反应后生成荧光产物,然后分析紫外线照射下的荧光图像,目前应用较多的荧光产物有4⁃甲基伞形酮(MUF)和7⁃氨基⁃4⁃甲基香豆素(AMC),以图像的灰度值与物质浓度做标准曲线,据此将土壤样品所得酶谱图像中的灰度值转化为对应的酶活性。


2 利用原位酶谱技术测定土壤酶活性

2.1 植物根际土壤酶活性及其主要影响因子

   土壤酶是根际物质周转和养分代谢的重要催化剂与参与者,是根际微生物群落组成、活性和功能变化的敏感指标。而土壤原位酶谱技术可以直观、准确的展示酶活性沿根系的分布及其时空变化,对于理解土壤理化因子及植物生理特性对土壤⁃根系⁃土壤微生物相互作用具有十分重要的意义。


(1) 植物根系发育和根形态

   根际沉积物包括脱落的根冠和表皮细胞、死亡和裂解的根细胞、根排放的气体、根被动和主动分泌物以及来自根表的胶状物质,分解根际沉积物和土壤有机质的酶的数量和种类都随时间和植物物种的变化而变化。例如,豆科植物根际土壤中的酶从根表向外的分布范围(根际范围)普遍大于禾本科植物,但酶的活性却显著低于禾本科植物。此外,根际土壤酶的活性沿豆科植物根系的分布较均一,而在禾本科植物则表现出明显的部位差异性,例如包括β⁃葡萄糖苷酶等 在内的多种酶的活性及其根际效应范围从豆科植物根基部到根尖大体呈均匀分布,仅在接近根尖时范围逐渐减弱,这些酶在禾本科植物则是在根尖或根基部酶活性范围及活性有最大值。不同植物种类,根系的不同部分,甚至在根系的不同发育阶段,根际土壤酶活性的强弱、沿剖面的分布和根系作用范围都有所不同。而土壤原位酶谱技术因其直观的空间表达性,改变了对植物根际土壤酶活性的传统认知,揭示了不同植物物种及其生理状态对酶活性大小及其沿根系分布影响的差异性,对深入、准确地 认识植物生理及植物⁃土壤反馈具有重要的意义。


(2)施肥

   土壤中胞外酶的活性与植物、微生物所需资源的可给性往往呈负相关关系,其中磷酸酶最为突出,而由于土壤氮素转化过程复杂,氮转化相关酶与土壤有效氮的关系较弱。施用速效肥料改变了资源的可给性,进而影响了植物及微生物胞外酶的释放。例如,土壤原位酶谱研究表明,施用磷肥不仅不会刺激磷酸酶的活性,反而可能使其降低。此外,酸性磷酸酶和碱性磷酸酶对速效磷肥的响应并不一致。添加速效磷肥后无论根际还是非根际土壤中的碱性磷酸酶活性都有明显下降,但根际土壤中的酸性磷酸酶活性只略微降低或者不受影响。这一现象在越贫瘠的土壤中越明显,原因在于酸性磷酸酶主要来自植物根系,而碱性磷酸酶主要由土壤微生物分泌,而相比于植物根系,产生碱性磷酸酶的土壤微生物受磷可利用性的影响更大。施用速效肥料一方面可能会抑制植物和微生物为获取该养分而分泌的胞外酶的活性,另一方面也可能间接增加其他酶的活性及根际范围。


(3)土壤水分变化

   土壤水分是养分运输的载体,也是土壤中酶与底物反应的重要介质。采用土壤原位酶谱方法 研究发现,土壤容积含水量通过影响酶和底物的扩散进而影响土壤酶活性。土壤复湿后磷酸酶活性快速回复到原有水平,进一步说明了土壤含水量是酶活性的重要控制因子。土壤含水量也影响磷酸酶在根际与非根际土壤中的分布,由于根系分泌的黏液等物质的作用,不仅在土壤干旱过程中根际区含 水量一直高于非根际区,而且根际区含水量降低更为缓慢,但是当土壤复湿时,根际含水量恢复的速度同样也滞后于非根际区。


(4)土壤温度变化

温度变化可直接改变酶的构象灵活性,也可以间接影响微生物活性及群落变化,进而作用于土壤及根际的酶活性。利用土壤酶谱技术原位研究温度变化对土壤酶活性的影响,有助于更透彻地了解土壤酶对 气候变化响应的微观空间特征。在一定的温度范围内,酶活性一般随着温度的升高而增大。农业大棚实验发现,玉米根际磷酸酶、纤维素 酶和亮氨酸氨肽酶的酶活性热区面积在 30℃下最大,温度较高时酶活性的热点区域增加得更快,扩展得更广,其原因可能与温度高时有机物分解速度较快,酶和底物的扩散速度也较快有关。


2.2 在土壤生态健康检测中的应用

土壤酶活性常用于监测重金属污染对生态系统健康的影响,其中磷酸酶活性对重金属胁迫敏感,被广泛用作土壤中重金属毒性的指示指标。在锌/铅矿产地不同程度受铅、锌、镉、铜污染的土壤上种植苜蓿, 直接酶谱法显示随着污染程度的增加,β⁃葡萄糖苷酶和磷酸酶的活性升高,热区面积所占比例增加。与上述结果不同,在开展的玉米铜胁迫实验中,向土壤施加硫酸铜显著降低了土壤 N⁃乙酰葡萄糖胺酶、β⁃葡萄糖苷酶 和磷酸酶的活性,加入纳米氧化铜也导致催化几丁质水解的 N⁃乙酰⁃β⁃D⁃葡萄糖苷酶活性略微下降。可能的原因为:(1)植物之间在生存策略和抗胁迫机理上存在差别,例如豆科植物与根瘤菌共生可以缓解自身的铜胁迫压力;(2)几丁质是真菌细胞壁的主要组成成分,纳米氧化铜对真菌有毒,可能导致真菌数量降低,N⁃乙酰⁃β⁃D⁃葡萄糖苷酶的底物减少,活性下降。传统的取样测定土壤酶活性的方法也能进行土壤生态健康检测,但是使用土壤原位酶谱技术可以有助于更加直观的理解污染下真实土壤酶的活性及范围变化,相比于潜在酶活性更加准确、真实。


2.3 在土壤动物与土壤酶活性关系研究中的应用

土壤原位酶谱法也已被广泛应用于研究土壤动物对土壤酶活性的影响,包括蚯蚓、线虫等。蚯蚓形成的孔隙系统被称为蚓触圈,是土壤微生物活动的“热区”之一,蚯蚓的粪便、黏 液、尿液中含有多糖、氨基酸和蛋白质等易分解的物质,其路径通道内微生物活性较高,能加速碳、氮、磷的转化和再分配。另外,蚯蚓的肠道也能分泌酶,如磷酸酶等。通过原位酶谱法研究显示,蚯蚓通道内壁的β⁃葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶、木聚糖酶、几丁质酶和酸性磷酸酶活性都明显大于无蚯蚓活动土壤,不同酶的活性范围相差较大,提示蚯蚓通道内与碳、氮循环相关的酶的活性变化大于促进磷循环的酶。土壤原位酶谱法展示蚯蚓洞穴是多种酶的热区,更清晰的展示了蚯蚓的活动对土壤酶活性和物质循环的促进作用。线虫是重要的小型土壤动物,部分线虫会寄生在农作物体内,它们通过刺穿和破坏细胞壁侵染根部,在根内活动并导致整个根部感染,进而改变植物根分泌物的数量和组成,影响根际酶活性。原位酶谱结果显示,线虫侵染促进了多叶羽扇豆的根向土壤中释放碳,使根际纤维二糖水解酶的分布范围变窄。线虫诱发的植物根结是水解酶的热点,也是吸引真菌和细菌等土壤微生物的资源富集区,线虫与生活在植物体内的其他病原体之间的养分竞争激烈。因为受线虫侵染的植物提升了对磷的需求,故而与纤维二糖水解酶相反,磷酸酶的活性有所提高,磷酸酶的根际范围增加,验证了土壤线虫对根际微生物的重要影响。原位酶谱技术对于揭示土壤动物⁃植物⁃微生物的相互关系具有十分重要的作用,但由于土壤环境的复杂性及土壤动物的迁移能力较强等因素,目前仍无法准确模拟土壤动物的运动轨迹,原位酶谱技术暂时还难以准确评估土壤动物对土壤酶活性、微生物及物质循环的整体影响。


2.4 土壤孔隙对土壤酶影响的原位酶谱研究

土壤孔隙是指土粒之间、团聚体之间以及团聚体内部的微小孔洞,是容纳水分和空气的空间,也是植物根系伸展和土壤动物、微生物活动的场所。土壤孔隙度的大小会直接影响土壤的保水性和通气性,创造独特的水、气空间,从而间接影响土壤微生物及土壤酶的活性。将土壤原位酶谱技术结合 X 射线 μCT 技术,发现在非根际区土壤孔隙在 60—180 μm 范围内时酶活性(磷酸酶、纤维素酶、木质素酶、几丁质酶 和亮氨酸氨基肽酶)最高,这验证了非根际区域微生物栖息的最佳孔隙范围,直接证实了土壤物理结构对微生物的生存的重要性,为非根际区的酶学研究和微生物研究提供了良好的理论基础。


土壤原位酶谱技术借助其无损、原位的特点和空间分辨率优势克服了传统土壤酶学技术的不足,可直观地展示各种因素影响下酶活性沿根的分布及其时空变化。正因为如此,该技术引入后,已从技术讨论和根际研究逐渐拓展到探究酶活性与土壤理化、土壤动物的关系、揭示其机理的重要研究中。原位酶谱技术已在根际酶活性研究中运用成熟,但在非根际环境中应用仍然较少,且缺乏系统性,难以评估各研究中偶然因素的影响,所得结论缺乏普适性,难以直接借鉴。此外,土壤原位酶谱技术也有自身的局限性,目前还只能研究有活性、难降解、可扩散的酶及迁移能力较弱的物种。虽然目前该技术还有诸多不足,但该技术的潜力巨大,未来随着科技的整体发展,相信原位酶谱技术也会不断改进,特别是与其他技术结合,在揭示土壤“黑箱”中的物质周转、养分转化、污染物消解等关键过程的研究中发挥更大的作用。


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